INTRODUZIONE PER UN CORRETTO E OTTIMALE UTILIZZO DELLE MICROPIPETTE

I volumi di pipettaggio più piccoli
- Millilitro (mL)
- Microlitro (µL)
- Nanolitro (nL)

MODALITA' DI PIPETTAGGIO - Sistemi di pipettaggio

Breve definizione di erogazione di liquidi
Misurazioni precise e riproducibili di liquidi.
Transferimento in sicurezza senza rischi di contaminazione.

Strumento di base tradizionale
Una pipetta serologica graduata in vetro o materiale sintetico.
La lettura del volume è difficile per l’effetto ottico del liquido nella pipetta (effetto menisco).
La riproducibilità è legata alle capacità dell’operatore.

Micropipetta e macropipetta
Sino a 1000 µl (micro);
sino a 10 mL (macro).

Micropipetta multicanale
Modelli a 8 o 12 canali.
Ideale per piastre a 96 pozzetti.

Micropipetta a erogazione positiva
Non c’è il cuscinetto d’aria, il pistone è a diretto contatto con il liquido da erogare che viene spinto fuori.


Sistemi di pipettaggio
- Pipetta ripetitiva
Erogazione in serie (µL o mL) di reagenti. Un puntale più grande funziona da riserva oppure il liquido è aspirato da un flacone tramite un tubo in silicone.

- Dispensatore con flacone
Erogazione diretta del liquido da un flacone contenente il reagente (in genere mL).

- Strumenti elettronici
Il pistone è guidato da un motore in combinazione con un microprocessore. Differenti programmi offrono più funzioni rispetto alle tradizionali micropipette manuali.

TIPOLOGIE DI MICROPIPETTE - Modelli di Micropipette

Micropipette a cuscinetto d’aria
Un cuscinetto d’aria (volume morto) si posiziona tra il liquido ed il pistone. La corsa del pistone avviene in due fasi:
(1) erogazione iniziale di liquido
(2) espulsione del liquido finale



Vantaggi
La pipetta non viene mai in contatto diretto con il liquido aspirato nel puntale monouso.
Svantaggi
La precisione della pipetta dipende dalla sua costruzione. Fattori critici sono la viscosità e la densità del liquido da erogare e le dimensioni del cuscinetto d'aria.

Micropipette ad erogazione positiva
Il liquido è a diretto contatto con il pistone ed è espulso dalla corsa del pistone. Il pistone si trova in un tubo capillare in vetro.



Vantaggi
Migliori prestazioni nel pipettaggio di liquidi viscosi o volatili. E’ eliminato il rischio di contaminazione crociata da aerosol.
Svantaggi
Il pistone deve essere in materiale inerte e resistente agli attacci chimici (ad esempio Teflon).

IMPORTANZA DEI PUNTALI
I puntali sono una parte fondamentale del sistema di pipettaggio.
Essi devono essere conformi ai seguenti criteri:

- Esenti da contaminazione biologica e chimica
- Fabbricati in materiale resistente agli attacchi chimici (in genere PP)
- Puliti, esenti da polvere
- Devono agganciarsi perfettamente alla punta della micropipetta
- Devono essere stampati con superfici liscie e senza alcun difetto
- Disponibili in diverse confezioni (sacchetto, rack o refill)

Esempi di puntali
- Puntali Micro
- Puntali gialli o blu
- Puntali per gel
- Puntali allungati
- Puntali Macro

Puntali con Filtro
Hanno lo scopo di bloccare l’aerosol e proteggere sia la micropipetta che il campione. Non sono efficienti contro vapori e solventi. Evitano le cross-contaminazioni.

TECNICHE DI PIPETTAGGIO - Impiego della micropipetta a cuscinetto d'aria

Pipettaggio diretto
E’ il modo più comune di impiego di una micropipetta.
Adatto per la maggior parte dei reagenti liquidi.
Il volume aspirato corrisponde al volume erogato.
Con la seconda pressione sul pulsante di comando, tutto il liquido viene espulso dal puntale.

Premere il pulsante di comando: il pistone elimina parte del volume morto.
- Immergere il puntale nel liquido da prelevare.
- Rilasciando la pressione sul pulsante di comando, il liquido viene aspirato.
- Sollevare il puntale dal liquido facendolo scorrere lungo la parete del recipiente ed appoggiare la punta del puntale contro la parete del recipiente ricevente.
- Premere il pulsante di comando sino al primo fermo; continuare la pressione sino al secondo fermo per far defluire i residui di liquido rimasti.
- Premere l’espulsore per far staccare il puntale dalla micropipetta.

Pipettaggio inverso
Sistema di pipettaggio particolare, adatto per liquidi leggermente viscosi o che tendono a produrre schiuma. Il volume di liquido aspirato è più grande di quello necessario. Si migliora la precisione su piccoli volumi di campione o nel pipettaggio ripetitivo.

Premere il pulsante sino al secondo fermo.
- Immergere il puntale nel liquido.
- Rilasciare la pressione sul pulsante: il liquido viene aspirato.
- Sollevare il puntale dal liquido facendolo scorrere lungo la parete del recipiente e adagiarlo sulla parete del recipiente ricevente.
- Premere il pulsante di comando sino al primo fermo: il volume programmato sarà erogato.

- Rimuovere la micropipetta dal recipiente ricevente e premere il pulsante sino al secondo fermo per espellere il liquido residuo.
- Premere l’espulsore per staccare il puntale dalla micropipetta.

Pipettaggio ripetitivo
Si basa sul pipettaggio inverso. Si adatta per test routinari e pipettaggi in serie per ridurre il movimento del pollice.

- Premere il pulsante sino al secondo fermo. Immergere il puntale nel liquido.
- Rilasciare la pressione sul pulsante: il liquido sarà aspirato.
- Sequenze di aspirazioni ed erogazioni mantenendo il liquido del secondo fermo come riserva.

- Rimuovere la micropipetta dal recipiente di ricevimento e premere il pulsante sino al secondo fermo per eliminare il liquido residuo.
- Premere l’espulsore per allontanare il puntale.

Applicazione speciale - Mescolamento
Operazione molto importante nella fase analitica di preparazione. Il mescolamento si ottiene con ripetute aspirazioni ed erogazioni, mantenendo il puntale sempre immerso nel liquido.
Adottare un movimento lento del pistone per evitare la formazione di schiuma o l’entrata di goccie nella micropipetta.

FONTI DI ERRORE DURANTE I PIPETTAGGI - Errori di pipettaggio - Fonti di errore

Ambiente (in genere errori sistematici)
- Tipo di liquido (viscoso, volatile, densità)
- Temperatura (stanza, liquido, strumento)
- Umidità (correlata alla evaporazione)
- Pressione Atmosferica

Strumento (in genere errori sistematici)
- Condizioni dello strumento (sporco, rotto).
- Mancanza di calibrazione (strumento vecchio, usato).
- Puntale non adatto (dimensioni non idonee).
- Una cattiva precisione è spesso da addebitare a cattive condizioni di manutenzione ed uso dello strumento.

Operatore (errore sistematico e random)
- Personale non addestrato correttamente.
- Disattenzione durante il pipettaggio.
- Movimenti e posizione di pipettaggio errati.
- Aspirazione ed erogazione errate.
- Un cattivo CV può essere indice di errori dell’operatore durante il pipettaggio.

Contaminazione (microbiologia o biologia molecolare)
- Strumento sporco.
- Mancanza di cura durante la sostituzione del puntale.
- Mani non protette.
- Banco di lavoro, ambiente di lavoro.
- La protezione ottimale si ottiene lavorando sotto cabina di sicurezza biologica.

MANUTENZIONE DELLE MICROPIPETTE PER UN FUNZIONAMENTO OTTIMALE -Manutenzione

- Controllare lo strumento a intervalli regolari per mantenerlo in ottime condizioni.
- Pulirlo regolarmente e proteggerlo dalle contaminazioni.
Evitare shock o esposizione a liquidi corrosivi o calore.
- Una buona manutenzione allunga la vita della micropipetta e consente di evidenziare anticipatamente eventuali anomalie.

Controllo visivo
Pulire ed asciugare il canale dell’aria ed il pistone in caso di accidentali penetrazioni di liquido. Lasciare le parti smontate ad asciugare prima della lubrificazione e del rimontaggio.

Test di funzionamento
Sostituire gli O-ring o altre parti ogni qualvolta sia necessario per perdita di tenuta o volume di liquido erogato irregolare. Lubrificare il pistone leggermente con grasso al silicone. Lubrificare un pistone nuovo o pulirlo con detergente.

Frequenza
Pulire, lubrificare e controllare lo strumento almeno una volta all’anno o a seconda della frequenza d’uso.

Conservazione delle micropipette
Le micropipette devono essere mantenute in posizione verticale su specifici supporti.

Spedizione delle micropipette
Conservare la scatola originale della micropipetta per la eventuale spedizione al produttore.

STERILIZZAZIONE E PULIZIA DELLE MICROPIPETTE - Sterilizzazione

La sterilizzazione può essere necessaria come azione preventiva o per decontaminare uno strumento che è stato a contatto con materiale biologico patogeno o potenzialmente patogeno.
Si possono impiegare diversi metodi, ma i più idonei per le micropipette sono:

- Vapore (autoclavatura a 121°C, 20 minuti)
- Gas (Ossido di etilene)

CONTROLLI PERIODICI DELLE MICROPIPETTE

Protocollo Standard
- Attenersi sempre al protocollo prestabilito.
- Il personale addestrato deve eseguire scadenziati controlli.
- Lo strumento deve essere sempre pulito e mantenuto in perfette condizioni di lavoro.
- Le temperature dello strumento, del locale, del liquido devono essere stabilizzate (ad esempio 22°C).
- Usare una bilancia analitica a lettura digitale (5 cifre decimali oltre 20 µL, 6 cifre decimali sotto 20 µL).
- Portare a termine il controllo della micropipetta in un sol tempo (senza pause).
- Usare puntali raccomandati dal costruttore della micropipetta.
- Non riciclare i puntali utilizzati per il controllo.

Procedura
- Inserire il recipiente pulito sul piattello della bilancia.
- Azzerare la bilancia.
- Applicare un puntale nuovo alla micropipetta e risciacquarlo due volte.
- Aspirare il campione: nessun liquido deve rimanere adeso alla parete esterna del puntale.
- Svuotare completamente il liquido nel recipiente sulla bilancia. Nessun liquido deve rimanere nel puntale.
- Attendere la stabilizzazione della bilancia e registrare la lettura (in mg).
- Azzerare la bilancia.
- Ripetere la misurazione per il numero di volte riportato nella POS (i.e.10 x).
- Calcolare il valore medio e trasformare il peso in volume (fattore Z = densità dell’acqua ad una data temperatura e pressione atmosferica).
- Fare la necessaria valutazione statistica (mean error, CV).
- Raffrontare i valori ottenuti di inaccuratezza e imprecisione con i valori raccomandati.
- Se necessario, eseguire la calibrazione seguendo le istruzioni del fabbricante.
- Eseguire sempre la calibrazione prima sui valori più bassi e poi su quelli più alti.

Controllo della micropipetta
Il cambio di un O-ring o di una parte inferiore della micropipetta richiede un controllo routinario. Una nuova calibrazione si rende necessaria solo quando si sostituisce il pistone, il cilindro oppure il meccanismo di regolazione.

PARAMETRI DA CONTROLLARE IN UNA MICROPIPETTA

Parametri
Per mantenere lo strumento in perfette condizioni di lavoro, si dovrebbero regolarmente tenere sotto controllo le prestazioni della micropipetta.

Il fabbricante indica sempre due valori nelle specifiche:
Accuratezza
Differenza tra il valore medio ed il valore nominale (volume target) spesso indicato in % del valore nominale (Rel.err. %).
xi = Risultato della pesata
X = Valore medio
n = Numero di misurazioni
Z = Fattore di correzione (densità)
V = Volume medio
E = Errore
E% = Accuratezza (%)
V0= Volume nominale
Fattori influenzanti l’accuratezza
- Costruzione della micropipetta (cuscinetto d’aria).
- Qualità dei puntali.
- Manutenzione della micropipetta.
Precisione
Riproducibilità, deviazione tra misure ripetute ottenute per calcolare il valore medio, dato come coefficiente di variazione (CV%).
S = Deviazione Standard
CV = Coefficiente di variazione (%)
Fattori influenzanti la precisione
- Velocità di pipettaggio
-“Forza” di pipettaggio
- Tecnica di pipettaggio

CALIBRAZIONE DELLE MICROPIPETTE

Calibrazione
Quando richiesto (ed in particolare quando si devono pipettare liquidi viscosi o a base non acquosa) il personale di laboratorio deve essere in grado di eseguire la calibrazione.
- Programmare la micropipette al valore minimo
- Raggiungere la vite di calibrazione c) che si trova all’interno del pulsante di comando, togliendo il cappuccio a)
- Con una chiave M3 Allen key b) ruotare delicatamente la vite di calibrazione in senso orario per diminuire il volume e viceversa.
- A regolazione effettuata, controllare il volume di liquido erogato.
- Riapplicare il cappuccio di protezione al pulsante di comando.

NORMATIVE
DIN 12650 “Plunger operated volumetric apparatus”
Normativa tedesca.

ISO DIS 8655 “Plunger operated volumetric apparatus”
Nuove normative internazionali in discussione.

ISO 9000 “Quality insurance”
Normative Internazionali della serie (9001, 9002, 9003) dove tutte le procedure di una società devono essere chiaramente descritte e seguite in accordo a specifiche norme.

CONCLUSIONI
Considerazione finale
La preparazione del campione ed in modo particolare il pipettaggio sono determinanti per la qualità del risultato analitico in laboratorio.
Per il corretto utilizzo della micropipetta sono estremamente importanti anche la manutenzione e la calibrazione che vanno eseguite secondo protocolli e regole ben precise.